25 päivän staattisen inkuboinnin jälkeen 28 °C:ssa *Pleurotus ostreatus* NRC620 -sienestä peräisin oleva lakkaasi osoitti korkeinta aktiivisuutta sieniviljelyalustassa. Tämän entsyymin optimaaliset pH- ja lämpötila-arvot olivat vastaavasti 3,0 ja 70 °C. Kahden tunnin inkuboinnin jälkeen 40 °C:ssa ja 50 °C:ssa entsyymiaktiivisuus säilyi 68,33 %:ssa ja 59,61 %:ssa. Kahden tunnin inkuboinnin jälkeen sitraatti-fosfaattipuskurissa (pH 7,0) entsyymiaktiivisuus pysyi 100 %:ssa. 10 mM MgSO₄:n ja CuSO₄:n lisääminen lisäsi entsyymiaktiivisuutta noin 21 % ja 35 %, kun taas NaCl, MnCl₂, KCl ja CaCl₂ estivät entsyymiaktiivisuutta. Käyttämällä ABTS:ää substraattina, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 -lakkaasin kineettiset parametrit (Km ja Vmax) olivat vastaavasti 1,99 mM ja 16 217 μmol min−1 L−1. Omenamehunäytteiden entsymaattinen käsittely alensi merkittävästi sekä pH:ta että viskositeettia, ja tämä lasku korreloi säilytysajan pidentymisen kanssa. Lakkaasikäsittely johti omenamehun kokonaisfenolipitoisuuden lievään laskuun, mutta antioksidanttiaktiivisuuden vähenemistä ei havaittu.
Viime vuosina tutkijat ovat keskittyneet vihreän bioteknologian soveltamiseen elintarviketeollisuudessa. Lakkaasi on yksi hyödyllisimmistä entsyymeistä elintarviketeollisuudessa, ja sitä käytetään muun muassa mehujen valmistuksessa, leivonnassa, viinin stabiloinnissa ja elintarvikkeiden aistinvaraisten ominaisuuksien parantamisessa.1Monet korkeammat kasvit ja mikro-organismit erittävät lakkaasia,2ja sienet, kuten deuteromykeetit, ascomykeetit ja basidiomykeetit, voivat myös tuottaa lakkaasia.3Lakkaasi (EC 1.10.3.2) on sininen oksidaasi, joka pelkistää molekyylihapen vedeksi käyttämällä kolmesta eri kupariatomista koostuvaa järjestelmää, hapettaen siten erilaisia fenoliyhdisteitä ja aromaattisia amiineja. Hedelmä- ja vihannesmehujen valmistuksessa entsymaattinen ja ei-entsymaattinen ruskistuminen ovat kriittisiä kysymyksiä.4Koska nämä aineet vaikuttavat negatiivisesti mehun väriin, makuun ja tuoksuun, ne on poistettava.5
Kaikista hedelmistä omenat ovat eniten kulutettuja hedelmiä maailmanlaajuisesti ja Euroopan unionissa. Vuonna 2019 omenantuotanto oli kolmanneksi suurin maailmanlaajuisesti yli 87 miljoonalla tonnilla.6Omenat sisältävät lukuisia fenoliyhdisteitä, kuten flavonoideja ja fenolihappoja, kuten kofeiinihappoa ja kloorigeenihappoa.7Koska omenamehua nautitaan tyypillisesti kirkkaassa muodossaan, noin 50–90 % fenolikomponenteista häviää suodatusprosessin aikana.8Nykyään kuluttajat valitsevat usein minimaalisesti prosessoituja tuotteita, kuten sameaa omenamehua, jossa on paljon polyfenoleja. Korkean fenolipitoisuutensa vuoksi tämäntyyppinen omenamehu on kuitenkin erityisen altis värjäytymiselle ja tummumiselle.9Omenamehun tummumisen vähentämiseksi tai estämiseksi käytetään erilaisia tekniikoita, mukaan lukien lämpökäsittelymenetelmät, kuten pastörointi 60–90 °C:ssa.10Kuitenkin Sauceda-Gálvezin tutkimuksen mukaan11Lämpökäsittely voi tuhota haihtuvia kemikaaleja ja vaikuttaa omenamehun aistinvaraisiin ominaisuuksiin. Vaihtoehtoja lämpökäsittelymenetelmille ovat ylikriittinen hiilidioksidi, ultraviolettisäteily, ultraääni, korkea hydrostaattinen paine tai korkeapainehomogenisointi.12Näiden teknologioiden tehokkuus ja sopivien hedelmämehujen saanto riippuvat käytetyistä parametreista ja tuotteen ominaisuuksista. Niiden laajamittaista käyttöä rajoittavat korkeat kustannukset, joidenkin elintarvikkeiden laatuun kohdistuvat haitalliset vaikutukset tai riittämätön entsyymien inaktivointi.13,14
Lakkaasia voidaan käyttää hedelmämehun stabilointiin ja kirkastamiseen.15Gökmen ym.16suosittelevat lakkaasin käyttöä hedelmämehun kirkastamiseen, koska se poistaa tehokkaasti fenoliyhdisteet muuttamalla ne polymeereiksi tai oligomeereiksi, jotka voidaan helposti poistaa millä tahansa ultrasuodatuskalvolla, jolloin omenamehun väri ja kirkkaus pysyvät vakaana jopa kuusi viikkoa 50 °C:ssa. Puhdistettua *Trichoderma*-lakkaasia immobilisoitiin alumiinioksidihelmiin ja sitä käytettiin omenamehun mikrobikontaminaation aiheuttamien sivumakuisten yhdisteiden selektiiviseen poistamiseen.17
Noin 80–90 % omenamehun haihtuvista ainesosista on estereitä ja aldehydejä, jotka antavat mehulle ainutlaatuisen aromin.18Omenamehun kirkastamista varten *Trametes versicolor* -lajikkeen lakkaasi kiinnitettiin edulliseen, nuorten kookospähkinänkuorien luonnonkuidusta valmistettuun tukeen.19Aiemmissa tutkimuksissa on tutkittu omenamehun stabilointia (väri ja sameus) entsyymivapailla tai immobilisaatiomenetelmillä tai yhdessä ultrasuodatuksen kanssa.5,19Sienilakkaasien vaikutus omenamehun fysikaalis-kemiallisiin ominaisuuksiin varastoinnin aikana on kuitenkin edelleen epäselvä. Siksi tämän tutkimuksen tavoitteena oli kokeellisesti tutkia omenamehun fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien, fenoliyhdisteiden pitoisuuden ja antioksidanttiaktiivisuuden muutoksia sienilakkaaseilla käsittelyn ja kahden viikon kylmäsäilytyksen jälkeen. Lakkaaseilla on kyky hapettaa fenoliyhdisteitä, mikä tekee niistä lupaavia käytettäväksi erilaisissa teollisissa prosesseissa, mukaan lukien mehun kirkastaminen. Tässä tutkimuksessa tutkittiin *Pleurotus ostreatus* NRC 620 -sienestä saatuja lakaaseja keskittyen niiden aktiivisuuden ja tehokkuuden ihanteellisiin olosuhteisiin mehun kirkastamisessa. Vaikka osterivinokkaita (P. ostreatus NRC 620) koskeva tutkimus on vielä rajallista, aiemmissa tutkimuksissa on tutkittu entsyymejä eri sienilähteistä, kuten Trametes versicolor ja Ganoderma lucidum. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida tämän entsyymin mahdollista käyttöä elintarviketeollisuudessa ja korostaa sen ainutlaatuisia ominaisuuksia, erityisesti sen ihanteellista pH:ta ja lämpötilaa.
2,2′-atsooksibis(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo) (ABTS) ostettiin Sigma-Aldrichilta (Kanada). Kaikki muut reagenssit olivat analyysilaatua.
Kansallisen tutkimuskeskuksen mikrobiviljelykeskus hankki tunnetun osterivinokasta peräisin olevan kannan NRC620. Jatkoviljelyn jälkeen tätä kantaa säilytettiin perunadekstroosiagar-vinoalustoilla 4 °C:ssa. Inokulaatin valmistusmenetelmä oli seuraava: 10 päivää vanha, täysin kehittynyt rihmasto inokuloitiin perunadekstroosiagarlevyille ja inkuboitiin 28 °C:ssa. 10 päivän kuluttua kolme 12 mm:n halkaisijaltaan olevaa rihmastopalaa poistettiin agar-agarista steriilillä metallirei'ittimellä ja asetettiin 250 ml:n erlenmeyer-pulloihin, joissa oli vanutulpat, jotka sisälsivät 50 ml steriloitua viljelyalustaa (pH 5,0, kuten Othman et al. ovat aiemmin kuvanneet).20). Viljelmiä inkuboitiin 28 °C:ssa 18 päivän ajan. Sitten viljelmät suodatettiin Whatman nro 1 -suodatinpaperin läpi, ja tuloksena oleva supernatantti toimi entsyymilähteenä.
Lakkaasiaktiivisuus määritettiin käyttämällä ABTS:ää substraattina. Reaktioseos (2 ml) sisälsi 500 μl 0,3 mM ABTS:ää (liuotettuna 0,1 M natriumsitraattipuskuriin, pH 4,5) ja tarvittavan määrän tislatulla vedellä laimennettua entsyyminäytettä.21,22Koska lakkaasi voi hapettaa ABTS:n huoneenlämmössä (28 °C ± 2), ABTS:n hapettuminen määritettiin mittaamalla absorbanssin kasvu 420 nm:ssä (ε420= 36 000 cm³-1 M -1) käyttäen Agilent Carry-100 UV-spektrofotometriä. Yksi yksikkö lakkaasiaktiivisuutta tarvittiin hapettamaan 1 μmol ABTS:ää minuutissa. Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin menetelmällä käyttäen naudan seerumin albumiinia sisäisenä kontrollina.23,24
Kun entsyymi oli saatu osterivinokkaasta NRC 620, sen aktiivisuutta mitattiin eri viljelyvälein 25 päivän ajan staattisissa olosuhteissa 28 °C:ssa.
Lämpötilan vaikutuksen lakkaasiaktiivisuuteen tutkimiseksi kokeita tehtiin lämpötila-alueella 20–90 °C. Ennen entsyymin lisäämistä ja reaktion aloittamista puskuri (0,1 M natriumsitraatti, pH 4,5) ja substraatti (ABTS) sekoitettiin ja inkuboitiin 5 minuuttia eri lämpötiloissa. Entsyymin terminen stabiilius arvioitiin inkuboimalla 0,05 M natriumfosfaattipuskurissa (pH 7,0) 40, 50, 60 ja 70 °C:ssa 2 tunnin ajan. Jäännösaktiivisuus arvioitiin sitten käyttämällä ABTS-substraattia.
pH:n vaikutusta lakkaasiaktiivisuuteen arvioitiin käyttämällä ABTS:ää substraattina 0,1 M sitraatti-fosfaattipuskureissa, joiden pH-alue oli 2,5–7,0. Entsyymiliuosta inkuboitiin 40 °C:ssa kaksi tuntia 0,1 M sitraatti- ja Tris-puskureissa (pH 3, 4, 6 ja 7) pH:n stabiilisuuden arvioimiseksi. Jäännösaktiivisuus ABTS:n ollessa substraattina laskettiin inkuboinnin jälkeen.
Lakkaasia inkuboitiin 10 minuuttia natriumfosfaattipuskurissa (0,05 M, pH 7,0), joka sisälsi erilaisia metalli-ioneja (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ ja Mn2+) pitoisuuksina vastaavasti 2,5 mM ja 10 mM. Substraatti (ABTS) lisättiin sitten reaktion aloittamiseksi ja suhteellinen aktiivisuus arvioitiin.
ABTS:n hapettumista lakkaasilla mitattiin eri pitoisuuksilla (0,025–3 mM) pH-arvossa 4,5 kineettisten parametrien (Vmax ja Km) määrittämiseksi.vakiotMichaelis-Menten-yhtälön kineettiset vakiot laskettiin Lineweaver-Burk-kuvaajalla, joka piirtää reaktionopeuden käänteisluvun substraattipitoisuuden funktiona. Kineettiset vakiot laskettiin Lineweaver-Burk-kuvaajasta käyttämällä GraphPad Prism versio 6.01 -ohjelmistoa.
Omenat pestiin huolellisesti vesijohtovedellä, minkä jälkeen ne leikattiin puoliksi ja mehustettiin täysautomaattisella Braun MP80 -omenamehulingolla (valmistettu Saksassa). Mehu suodatettiin neljän sideharsokerroksen läpi. Kontrolliryhmään ei lisätty entsyymejä, kun taas vastavalmistettuun omenamehuun lisättiin 2,0 % lakkaasia (tehokkain testattu pitoisuus), ja mehu säilytettiin 4 °C:ssa kaksi viikkoa.
Titrattava happamuus (TA) ja pH määritettiin Boultonin ym. menetelmän mukaisesti.al.27Kunkin näytteen pH mitattiin digitaalisella pH-mittarilla (JENWAY 3510 pH-mittari). Titrattava happamuus (TA) laskettiin omenahapon perusteella seuraavaa kaavaa käyttäen.
Jossa V ja C ovat titrauksessa käytetyn natriumhydroksidiliuoksen tilavuus (ml) ja konsentraatio (0,1 mol/l). K on omenahapon konversiokerroin, joka on 0,067, ja W on omenamehun massa (g).
Liukoisten kiintoaineiden kokonaismäärä (TullimaksuKaikkien mehunäytteiden HCl-pitoisuus määritettiin PAL-1-taskurefraktometrillä (ATAGO, Tokio, Japani). Jokaisen mittauksen jälkeen optinen linssi huuhdeltiin deionisoidulla vedellä ja jokainen omenamehunäyte testattiin kolme kertaa. Kunkin näytteen arvo laskettiin laskemalla kolmen mittauksen keskiarvo. Myös kunkin omenamehun näytteen keskiarvo ± keskihajonta laskettiin laskemalla näiden tulosten keskiarvo.
Omenamehunäytteiden viskoelastisuus arvioitiin pyörivällä viskosimetrillä (RV, Rheotest 2, Saksa). Näyte asetettiin viskosimetrin ”S2”-sylinteriin. Näennäinen viskositeetti määritettiin leikkausjännityksen ja leikkausnopeuden käyrän kulmakertoimella, joka laskettiin leikkausjännityksestä ja vastaavista käyristä eri leikkausnopeuksilla (1,00 - 437,4 s⁻¹). Näennäisen viskositeetin laskemiseen käytetään seuraavaa kaavaa:
Jossa η on näennäinen viskositeetti (cP), τ on leikkausjännitys (dyn/cm²), γ on leikkausnopeus (sec⁻¹) ja (τ) lasketaan käyttämällä vääntömomentin (α) ja sylinterin (Z) arvoja seuraavalla kaavalla: τ = Z . α.
Ruskeusindeksi määritettiin Meidav et ai. -menetelmän mukaisesti.al.2910 ml:n mehunäytettä sentrifugoitiin 2750 x g:n voimalla 10 minuutin ajan. 5 ml mehun supernatanttia sekoitettiin 5 ml:aan 95-prosenttista etanolia. Seoksen absorbanssi mitattiin 420 nm:ssä käyttäen Shimadzu UV-spektrofotometriä (UV-1601 PC).
Kokonaisfenolipitoisuus (TPC) määritettiin kolorimetrisesti käyttäen Folin-Ciocalteu-reagenssia Boultonin ym. kuvaamalla tavalla.[27]Gallihapon standardikäyrä konstruoitiin pitoisuuksille 0–500 mg/l (r²= 0,997). Tulokset ilmaistaan gallihappoekvivalentteina (mg GAE/ml).
Lisää 125 μl tislattua vettä ja 2850 μl FRAP-liuosta 25 μl:aan omenamehua ja anna seoksen seistä pimeässä30min. Mittaa sitten absorbanssi 593 nm:ssä käyttämällä Shimadzu UV-spektrofotometriä (UV-1601 PC). FRAP-reagenssi valmistettiin sekoittamalla 300 mM asetaattipuskuria (pH 3,6), 20 mM rauta(III)kloridia ja 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyyli)triatsiinia (TPTZ) (liuotettuna 40 mM HCl:aan) suhteessa 10:1:1. Standardikäyrä luotiin käyttämällä Troloxia standardina (R²= 0,999), ja tulokset ilmaistaan muodossa μM Trolox/ml.
Käsiteltyjen ja käsittelemättömien mehujen antioksidanttiaktiivisuus määritettiin DPPH-menetelmällä, jotta voitiin arvioida niiden kykyä sitoa DPPH-vapaita radikaaleja.31Kymmenen mikrolitraa mehua sekoitettiin 1 ml:aan DPPH-liuosta (100 μM) metanolissa. 30 minuutin pimeässä tapahtuneen reaktion jälkeen seoksen absorbanssi mitattiin 517 nm:ssä käyttäen Shimadzu UV-spektrofotometriä (UV-1601 PC). Tulokset ilmaistiin trolox-ekvivalentteina (μM trolox/ml) kalibrointikäyrän (R2= 0,990).
Saadut tiedot osoittivat, että NRC 620 -osterivinokaissa havaittiin maksimaalinen lakaasituotanto 18. käymispäivän loppuun mennessä, jolloin aktiivisuus oli 1302 U/l. Tätä käytettiin perustana optimaalisen viljelyajan määrittämiselle lakaasituotannolle (kuva 1). Vaikka entsyymituotanto kasvoi viljelyajan pidentyessä, kasvunopeus ei ollut suoraan verrannollinen viljelyaikaan; 21 päivän kuluttua entsyymiaktiivisuus oli lisääntynyt vain 90 U/l (1390 U/l:aan). Siksi optimaaliseksi viljelyajaksi valittiin lopulta 18 päivää, jotta tuotesaanto olisi tasapainossa pidemmän viljelyajan taloudellisten hyötyjen kanssa.
Viljelyajan vaikutus lakkaasin saantoon Pleurotus ostreatus NRC 620 -sienessä. Kolme (12 mm) sienirihmastoa inokuloitiin 50 ml:aan steriiliä kasvatusalustaa ja viljeltiin sitten 28 °C:ssa eri aikoja.
Muiden tutkimusten mukaisesti tuloksemme osoittavat, että ihanteellinen viljelyaika sienten lakkaasin erityksen huippupitoisuuden saavuttamiseksi on todennäköisesti 7–36 päivää.32Eziken ym. mukaan33*Trametes polyzona* WRF03 tuotti suurimman määrän lakkaasia yhdeksännen käymispäivän loppuun mennessä, ominaisaktiivisuudella 1637 U/mg proteiinia. Lisäksi Othman et al.34havaitsi, että *Trichoderma harzianum* S7113 eritti suuren määrän lakkaasia viljelyn viidentenä päivänä. Lakkaasin tuotantonopeus saavutti huippuaktiivisuuden neljäntenätoista päivänä ja laski sitten vähitellen.34Vaikka entsyymien eritys voi tapahtua myös pääkasvuvaiheen aikana, se on yleensä huipussaan välivaiheessa ja laukaisee hiilen tai typen lähteen kulutuksen.34,35
Vaikka Pleurotus ostreatus NRC 620:sta peräisin oleva lakkaasi osoitti korkeaa aktiivisuutta laajalla lämpötila-alueella 50 °C - 80 °C, lähellä huippuaktiivisuutta (69–98 %), sen maksimiaktiivisuus havaittiin 70 °C:ssa (kuva 2a). Tämän lämpötila-alueen ulkopuolella entsyymiaktiivisuus laski noin 70 °C:ssa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että entsyymi on aktiivinen korkeissa lämpötiloissa, todennäköisesti siksi, että korkea lämpötila lisää reaktion kineettistä energiaa.
Reaktiolämpötilan (a) ja pH:n (b) vaikutus lakkaasiaktiivisuuteen *Pleurotus ostreatus* NRC 620:ssa. Lämpötilat 20–90 °C saavutettiin esi-inkuboimalla seosta eri lämpötiloissa 5 minuutin ajan ennen entsyymin lisäämistä ja reaktion aloittamista. pH:n vaikutusta lakkaasiaktiivisuuteen arvioitiin käyttämällä ABTS:ää substraattina liuoksissa, jotka sisälsivät 0,1 M sitraatti-fosfaattipuskuria pH-alueella 2,5–7,0.
Eziken ym. mukaanal.33*Trametes polyzona* WRF03 -lakkaasin optimaalinen lämpötila on 55 °C, joka on sama kuin *Ganoderma lucidumin*.lakkaasi36ja samanlainen kuin *Trametes polyzona* KU-RNW02737:n optimaalinen lämpötila (50 °C)lakkaasi . Baldrian38huomauttaa, että kuten muidenkin ligniiniä hajottavien entsyymijärjestelmien, lakkaasin ihanteellinen lämpötila-alue on 50–70 °C.
Tulokset osoittivat, että entsyymi osoitti korkeinta aktiivisuutta pH-arvossa 3,0, saavuttaen 94 %:n aktiivisuuden pH-arvossa 3,5. Se pysyi kuitenkin aktiivisena laajalla pH-alueella 2,5–7,0 (kuva 2b). Lisäksi sen aktiivisuus oli korkeampi happamissa olosuhteissa verrattuna neutraaleihin tai emäksisiin olosuhteisiin. Sen aktiivisuus pysyi vähintään 77 %:ssa pH-alueella 2,5–4,5, mutta saavutti vain noin 38 %:n pH-arvossa 7,0. *Trametes polyzona* WRF03 -lajista peräisin olevan lakkaasin optimaalinen pH oli 4,533, joka on sama kuin *Trametes polyzona* KU-RNW02737:n, *Trichoderma harzanium* 39:n, *Pleurotus* sp. 40:n ja *Trametes hirsuta* 41:n lakkaasien pH. Chairin ym. tutkimuksen mukaan...42*Polymorpha f. sp.* WR710-1 -lajin lakkaasin optimaalinen pH on 2,2, kun taas *Polymorpha f. sp.* IBL-04 -lajin lakkaasin optimaalinen pH on 5,043. Hydroksidianionien (lakkaasin estäjä) sitoutuminen T2/T3-lakkaasin kupariatomeihin voi olla syynä lakkaasiaktiivisuuden vähenemiseen neutraaleissa tai emäksisissä pH-olosuhteissa. Tämä voi häiritä sisäistä elektroninsiirtoa T1-keskuksesta T2/T3-keskukseen, jolloinrajoittavaentsyymiaktiivisuus23,44
Inkuboimalla entsyymiä eri lämpötiloissa havaittiin, että sekä inkubointiaika että lämpötila vaikuttivat entsyymin stabiilisuuteen. Erityisesti *Trametes polyzona* NRC 620 -kannasta peräisin oleva lakkaasi osoitti parempaa stabiiliutta 40 °C:ssa ja 50 °C:ssa, säilyttäen 68,33 % ja 59,61 % alkuperäisestä aktiivisuudestaan 120 minuutin kuluttua (kuva 3a). Sitä vastoin samoissa olosuhteissa (40 °C ja 50 °C, 120 minuuttia) *Trametes polyzona* WRF03 -kannasta peräisin oleva lakkaasi säilytti 64,38 % ja 42,92 % aktiivisuudestaan.33Päinvastoin, inkubointiajan ja lämpötilan nostaminen vähensivät *Trametes polyzona* NRC 620 -lakkaasin stabiilisuutta; 60 minuutin inkuboinnin jälkeen 60 °C:ssa ja 70 °C:ssa sen aktiivisuus laski vastaavasti 39,24 %:iin ja 1,72 %:iin (kuva 3a). Kokeellisten tulosten mukaisesti *Trametes polyzona* WRF03:sta peräisin oleva lakkaasi osoitti parempaa stabiiliutta 40 ja 50 °C:ssa koko lämpökäsittelyprosessin ajan.33Samoin Lueangjaroenkit ym.al.37ja Chairin ym.al.42raportoi Trametes polyzona KURNW027:n ja Trametes polyzona WR710-1:n lakkaasien stabiiliudesta 50 °C:ssa yhden tunnin ajan. Lakkaasilla, jota voidaan käyttää hyödyllisenä biokatalyyttinä eri bioteknologian aloilla, tulisi olla hyvä stabiilius ja suorituskyky laajalla lämpötila-alueella.
*Pleurotus ostreatus* NRC 620 -lakkaasin termostaattinen stabiilius (a) ja pH-stabiilius (b). Termostaattista stabiilisuutta arvioitiin inkuboimalla entsyymiliuosta 0,05 M natriumfosfaattipuskurissa (pH 7,0) 40, 50, 60 ja 70 °C:ssa 2 tunnin ajan. pH-stabiilisuutta arvioitiin inkuboimalla entsyymiliuosta 0,1 M sitraattipuskurissa ja Tris-puskurissa (pH 3, 4, 6 ja 7) 40 °C:ssa 2 tunnin ajan. Jäännösaktiivisuus laskettiin käyttämällä ABTS:ää substraattina inkuboinnin jälkeen.
Optimaalisten entsyymien käyttö- ja säilytysolosuhteiden määrittämiseksi tutkimme pH:n vaikutusta lakkaasin stabiilisuuteen. Altistuminen eri pH-arvoille vaikutti merkittävästi proteiinirakenteen stabiilisuuteen, mikä puolestaan vaikutti entsyymimolekyylin stabiilisuuteen ja aktiivisuuteen. Tulokset osoittivat, että entsyymi oli vähemmän stabiili happamissa olosuhteissa, kun taas se osoitti parempaa stabiilisuutta korkeammissa pH-arvoissa (neutraalit ja emäksiset alueet). PH-arvoilla 7,0, 6,0, 4,0 ja 3,0 entsyymin retentionopeudet 120 minuutin kuluttua olivat noin 100 %, 62,54 %, 52,39 % ja 11,14 % (kuva 3b). *Strombus multisus* WRF03 -lakkaasi osoitti parempaa stabiilisuutta neutraaleissa pH-arvoissa (5,5–6,5) ja alhaisempaa stabiilisuutta happamissa pH-arvoissa (alle 4,0). 120 minuutin kuluttua pH-arvoilla 5,5, 6,0 ja 6,5 entsyymien pidättymisasteet olivat vastaavasti noin 82 %, 100 % ja 93 %.33Khairin ym.42totesivat, että Trametes polyzona WR710-1:stä peräisin oleva lakkaasi oli stabiili pH-alueella 6,0–7,0, kun taas Sayed ym.45osoitti, että lakkaasi oli stabiilimpi neutraaleissa pH-olosuhteissa. Cerrena unicolorista peräisin oleva lakkaasi osoitti kuitenkin stabiiliutta myös emäksisissä olosuhteissa (pH 9,0).46Tutkitut lakkaasit osoittivat korkeaa stabiiliutta laajalla pH-alueella. Tämä voi olla tärkeä ominaisuus teollisissa sovelluksissa.
Koska joillakin metalli-ioneilla on sekä stimuloivia että estäviä vaikutuksia entsyymiaktiivisuuteen, niiden vaikutukset entsyymiaktiivisuuteen on otettava huomioon teollisissa sovelluksissa. Tämä on ratkaisevan tärkeää, koska metalli-ionit ovat yleisiä ympäristön epäpuhtauksia, jotka voivat vaikuttaa solunulkoisten entsyymien stabiilisuuteen ja synteesiin.47Tutkiaksemme useiden metalli-ionien vaikutusta *Pleurotus ostreatus* NRC 620 -lakkaasiin, suoritimme vastaavia kokeita. Kuten kuvassa 4 on esitetty, käytetyn metallin tyypistä riippuen metalli-ionipitoisuuden nostaminen 2,5 mM:sta 10 mM:iin vaikutti negatiivisesti entsyymin toimintaan. Esimerkiksi,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺jaCu²⁺voisi stimuloida ja aktivoida entsyymiaktiivisuutta samallaNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺jaK⁺saattoi estää entsyymiaktiivisuutta. 10 mM:n pitoisuutena Cu²⁺- ja Mg²⁺-ionit olivat tehokkaimpia *Pleurotus ostreatus* NRC 620:n lakkaasiaktiivisuuden aktivaattoreita, ja niiden aktivaatioaste oli vastaavasti noin 34 % ja 20 %. 10 mM:n pitoisuutena Ca²⁺-ionit olivat kuitenkin tehokkain lakkaasin estäjä, ja ne vähensivät entsyymiaktiivisuutta noin 60 %.
Metalli-ionien vaikutus Pleurotus ostreatus NRC 620 -lakkaasin aktiivisuuteen. Lakkaasia inkuboitiin 10 minuuttia natriumfosfaattipuskurissa (0,05 M, pH 7,0), joka sisälsi erilaisia metalli-ioneja pitoisuuksina 2,5 mM ja 10 mM. Reaktio käynnistettiin sitten lisäämällä substraatti (ABTS), minkä jälkeen suhteellinen aktiivisuus mitattiin.
Tuloksemme ovat yhdenmukaisia muiden kirjoittajien tulosten kanssa, jotka havaitsivat, että Mg²⁺ ja Cu²⁺ lisäävät *Trametes polyzona* WRF03³:n aktiivisuutta. Castaño ym.⁴⁸ havaitsivat, että kupari-ionit (Cu²⁺) stimuloivat jossain määrin *Xylaria*-lajin lakkaasia. Lisäksi Foroutanfar ym.⁴⁹ ja Si ym.⁵⁰ tekivät samanlaisia tutkimuksia *Paraconiothyrium variabile*- ja *Trametes pubescens*-lajien lakkaaseilla. Tämän entsyymin tyypin II kuparin sitoutumiskohta (T2) voi olla kyllästynyt Cu²⁺:lla tietyllä pitoisuudella, mikä voi selittää lakkaasiaktiivisuuden stimulaation korkeammilla Cu²⁺³⁹-pitoisuuksilla. Koska valkomädäntävien sienten lakkaasit ovat useita kupariatomeja sisältäviä oksidaaseja, kupari-ionien vaikutukset lakkaasiaktiivisuuteen ovat moninaiset ja vaihtelevat stimuloivasta ja inhiboivasta neutraaliin.⁵¹ Sitä vastoin Zhou ym.[52]raportoi, ettäCu²⁺esti Taiwanin maanalaisen termiitin (Odontotermes formosanus) lakkaasiaktiivisuutta. Cerena sp. HYB07:n lakkaasit kuitenkin[53]ja Clitocybe maxima[54]kupari-ionit eivät vaikuttaneet niihin.
Substraattispesifisyyttä kuvattiin sen kineettisten parametrien (Km ja Vmax) avulla; mitä voimakkaampi substraatin sitoutumisaffiniteetti entsyymiin oli, sitä pienempi oli Km-arvo ja sitä suurempi oli substraattispesifisyys.3, 21, 55*Pleurotus ostreatus* NRC 620 -lajista peräisin olevan lakkaasin kineettiset parametrit (Km ja Vmax) määritettiin GraphPad Prism 6.0 -ohjelmistolla piirtämällä Lineweaver-Burk-kuvaaja (kuva 5). Käytettäessä ABTS:ää substraattina tulokset olivat 1,99 mM ja 16217 μmol.min⁻¹ L⁻¹,vastaavasti. Elsayed ym.21raportoi, että ABTS:n hapettumisen Km-arvot olivat vastaavasti 0,1 mM ja 0,064 mM, mikä osoittaa Lac A- ja Lac B -isoentsyymien korkean affiniteetin ABTS:ään. Lisäksi Vmax-arvot olivat 0,182 μmolmin⁻¹ja 0,603 μmolmin⁻¹. Saatu Km-arvo oli pienempi kuin Trametes polyzona WRF03:lla (8,66 mM); lisäksi niiden Vmax-arvo (1429 mmol min⁻¹) oli myösalentaakäytettäessä ABTS:ää substraattina.33 Vastaavasti Lentinus squarrosulus MR13:n ja Trametes sp. AH28-2:n lakkaasin Km-arvot olivat vastaavasti 0,0714 mM ja 0,025 mM, ja Vmax-arvot olivat 0,0091 mM min−1 ja 0,67 mM min−1 mg−1 (suhteessa ABTS:ään).vastaavasti.56,57
ABTS-pitoisuuden vaikutusta *Pleurotus ostreatus* NRC 620 -lajin lakkaasin aktiivisuuteen tutkittiin ja piirrettiin Lineweaver-Burk-kuvaaja, joka esitti reaktionopeuden käänteisluvun ABTS-pitoisuuden funktiona. ABTS:n hapetusreaktio eri lakkaasipitoisuuksilla (0,025–3,0 mM) mitattiin pH-arvossa 4,5 kineettisten parametrien (Vmax ja Km) määrittämiseksi. Michaelis-Mentenin kineettiset vakiot laskettiin käyttämällä Lineweaver-Burk-kuvaajaa, joka esitti reaktionopeuden käänteisluvun substraattipitoisuuden funktiona. Kineettiset vakiot laskettiin Lineweaver-Burk-kuvaajasta käyttäen GraphPad Prism 6.01 -ohjelmistoa.
Perinteiset kirkastavat entsyymit, kuten pektinaasit, hydrolysoivat pektiiniaineita vähentäen viskositeettia ja sameutta. Ne hajottavat tehokkaasti rakenteellisia polysakkarideja ja niitä käytetään usein yhdessä muiden entsyymien, kuten sellulaasien ja hemisellulaasien, kanssa saannon ja kirkkauden parantamiseksi. Pektinaasit eivät kuitenkaan kohdista erityisesti fenoliyhdisteisiin, jotka ovat tärkeimmät sameuden ja oksidatiivisen ruskistumisen aiheuttajat, erityisesti mehuissa, kuten omena- ja viinirypälemehussa.58Lakkaasit sitä vastoin katalysoivat fenoliyhdisteiden hapettumista polymeroimalla ne suuremmiksi, liukenemattomiksi molekyyleiksi, jotka voidaan poistaa sedimentaatiolla tai suodattamalla. Tämä mekanismi ei ainoastaan paranna kirkkautta, vaan myös pidentää mehun säilyvyyttä vähentämällä fenoliyhdisteiden aiheuttaman oksidatiivisen ruskistumisen todennäköisyyttä. Lisäksi lakaasipohjaisia kirkastusprosesseja voidaan suorittaa miedoissa prosessointiolosuhteissa (pH 3,5–5,5, lämpötila 25–40 °C), mikä tekee niistä sopivia herkille mehuille vaarantamatta niiden ravintoarvoja tai aistinvaraisia ominaisuuksia.59Tutkimukset ovat osoittaneet, että pektinaasikäsittely voi kirkastaa mehun 1–2 tunnissa, kun taas lakkaasin käsittely vaatii tyypillisesti pidemmän reaktioajan (3–6 tuntia) fenoliyhdisteiden täydelliseen pelkistämiseen. Tätä prosessia voidaan kuitenkin optimoida immobilisoimalla entsyymi tai yhdistämällä lakkaasin mekaanisiin kirkastusmenetelmiin.60Tässä tutkimuksessa raakauutteen entsyymiprofilointi paljasti merkittäviä lakkaasin ja α-amylaasin aktiivisuuksia, kun taas pektinaasin ja ksylenaasin aktiivisuudet olivat erittäin alhaiset, eikä sellulaasiaktiivisuutta havaittu. Siksi sameuden ja fenolipitoisuuden väheneminen johtui pääasiassa lakkaasin toiminnasta, kun taas viskositeetin muutos saattoi johtua osittain amylaasin toiminnasta.
Taulukossa 1 on esitetty vastapuristetun omenamehun ja lakkaasilla käsiteltyjen näytteiden fysikaalis-kemialliset parametrit. Tulokset osoittivat, että vastapuristetun omenamehun saanto (71,59 %) oli pienempi kuin lakkaasilla käsiteltyjen näytteiden saanto (87,34 %). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia Pilnikin ja Orangen havaintojen kanssa.61, jotka osoittivat, että entsyymien käyttö hedelmien jalostuksessa voi lisätä mehun saantoa, parantaa suodatusta ja saada korkealaatuista, kirkasta mehua väkevöintiä varten. Mehun saannon kasvu johtuu pääasiassa mehun liukoisten sokereiden pitoisuuden kasvusta. Hedelmien entsymaattisen hydrolyysin aikana tuotteen soluseinissä oleva mesoglea ja pektiini tuhoutuvat ja muuttuvat liukoisiksi aineiksi, kuten neutraaleiksi sokereiksi ja hapoiksi.62.Entsyymikäsitellyn omenamehun pH-arvo oli merkittävästi alhaisempi kuin kontrolliryhmällä (P < 0,05), ja molempien ryhmien pH-arvo nousi merkittävästi säilytyksen aikana (taulukko 1). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia Markin ym. tulosten kanssa.63, joka totesi, että cashewpähkinöiden hedelmämehun pH laski lämpökäsittelyn jälkeisen varastoinnin jälkeen. Pektiinin hajoaminen ja galakturonihapon muodostuminen entsyymikäsittelyn jälkeen saattavat olla vastuussa pH:n noususta varastoinnin aikana. Entsyymikäsiteltyjen näytteiden pH pysyi 4,05:n ja 4,31:n välillä koko varastoinnin ajan, kun taas käsittelemättömän omenamehun pH vaihteli 4,12:n ja 4,33:n välillä.
Sekä käsittelemättömien että lakkaasilla käsiteltyjen näytteiden kokonaishappoisuus (TA) laski varastointiajan pidentyessä (taulukko 1). Happamuuden lasku johtui orgaanisten happojen muuntumisesta hiilihydraateiksi tai entsymaattisista reaktioista sekä hapettumisesta mehun varastoinnin aikana.64Kontrollinäytteiden omenamehun ja entsyymikäsiteltyjen näytteiden kokonaishappoisuus oli alhaisempi kuin muiden mehujen (mansikkamehu 0,9 %, luumumehu 2,2 %, kumkvattimehu 1,0 %, aprikoosimehu 2,4 %, appelsiinimehu 0,8 %), mutta samanlainen kuin muiden mehujen (esim. päärynämehu 0,3 %).62Nämä erot käsittelemättömässä vastapuristetussa omenamehussa voivat johtua useista tekijöistä, kuten kasvuolosuhteista, geneettisistä tekijöistä, kypsyysasteesta ja käsittelymenetelmistä.65Kontrollin ja lakkaasilla käsitellyn omenamehun kokonaishappoisuuden lasku on yhdenmukainen Singhin ym. esittämien tulosten kanssa.66koskien Jin Nuo -omenamehun kokonaishappoisuuden vähenemistä 74 päivän säilytyksen jälkeen. Toisaalta Oshmiansky ja Wojdylo67ei havainnut merkittäviä muutoksia omenamehun happamuudessa tutkiessaan perinteisten kirkastusmenetelmien vaikutusta.
Taulukossa 1 esitetyt tulokset osoittavat, että lakkaasilla käsitellyn omenamehun liukoisten kiintoaineiden kokonaismäärä (TSS) oli korkeampi kuin käsittelemättömän näytteen. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia julkaistujen tutkimusten kanssa.. 68Lisäksi taulukko 1 osoittaa, että kontrolliryhmän omenamehupitoisuuden TSS-arvo oli 9,58 alkuvaiheessa ja nousi 11,05:een säilytysjakson loppuun mennessä. Nämä arvot ovat alhaisemmat kuin Hamidin ym. raportoimat tuoreen omenamehun TSS-arvot.. 69(11,2 ja 11,80, vastaavasti). Lakkaasilla käsiteltyjen omenamehunäytteiden TSS-arvo nousi merkittävästi arvosta 11,23 arvoon 12,93 kahden viikon varastoinnin jälkeen 4 °C:ssa (taulukko 1). Samanlainen TSS-arvon nousu varastoinnin aikana havaittiin myös sitrushedelmissä, sitruunoissa ja makeissa appelsiineissa. Liukoisten kiintoaineiden kokonaismäärän (TSS) nousu varastoinnin aikana voi johtua polysakkaridien (tärkkelyksen) hydrolyysistä monosakkarideiksi (sokereiksi), mehun kuivumisesta johtuvasta pitoisuuden noususta ja pektiinin hajoamisesta mehussa liukoisiksi kiintoaineiksi. Liukoisten kiintoaineiden kokonaismäärän (TSS) nousu johtuu todennäköisesti liukoisten sokereiden lisääntymisestä, joita voi muodostua pektiinin tai selluloosan muuntuessa liukoisiksi sokereiksi pektiinin tai sellulaasin vaikutuksesta tai tärkkelyksen hydrolyysistä sokereiksi, kuten Hamed et al. ovat raportoineet.69.Lakkaasin vaikutus omenamehun ominaisuuksiin voidaan havaita visuaalisesti, sillä lakkaasilla käsitellyn omenamehun juoksevuus on parempi ja viskositeetti alhaisempi kuin käsittelemättömän mehun. Tämä havainto on kirjattu taulukkoon 1; Entsyymikäsitellyn näytteen viskositeetti oli 1,87 cP, kun taas kontrollinäytteen viskositeetti oli 2,95 cP. Tämä merkittävä viskositeetin lasku johtuu todennäköisesti pektiinin kaltaisten aineiden suuremmasta vedenpidätyskyvystä ja kohesiivisen verkkorakenteen muodostumisesta.
Tässä tutkimuksessa tutkittiin lakkaasin vaikutusta omenamehun ruskistusindeksiin (BI) mittaamalla absorbanssi 420 nm:ssä spektrofotometrillä. Tulokset on esitetty taulukossa 1. Varastoinnin aikana omenamehunäytteiden ruskistusindeksi osoitti asteittaista nousutrendiä sekä käsitellyissä että käsittelemättömissä ryhmissä. BI heijastaa ruskistusastetta ja voi toimiatärkeäentsymaattisten ja ei-entsymaattisten ruskistumisreaktioiden indikaattori. Absorbanssi kasvoi merkittävästi varastoinnin aikana (P < 0,05). Varastoinnin lopussaA420Omenamehunäytteiden ruskistusarvo nousi kontrolliryhmässä ja entsyymikäsitellyssä ryhmässä noin 217 % ja 121 % (taulukko 1). Tulokset osoittavat, että entsyymikäsittely voi tehokkaasti vähentää ruskistusastetta noin 56 %. Bezerra et al.:n tulokset...[19]] ovat yhdenmukaisia tulostemme kanssa; He käyttivät lakkaasi-glutaraldehydi-kookoskuitua omenamehun kirkastamiseen, mikä vähensi sen alkuperäistä väriä 61 %.
Vaikka hedelmämehujen polyfenoleilla on positiivisia ravitsemuksellisia ja terapeuttisia vaikutuksia ihmiskehoon, ne voivat myös reagoida proteiinien kanssa aiheuttaen mehun sameutta, sedimentaatiota tai sameutta, mikä muuttaa tuotteen makua ja aromia ja lyhentää sen säilyvyyttä.71Tämän tutkimuksen tavoitteena oli vähentää turvallisesti omenamehun fenoliyhdisteiden pitoisuutta käyttämällä Pleurotus ostreatus NRC 620 -lajista saatua lakaasia. Taulukossa 1 esitetyt tulokset osoittavat, että lakaasilla käsitellyn omenamehun fenoliyhdisteiden kokonaispitoisuus väheni merkittävästi ennen varastointia 4 °C:ssa. Lisäksi fenoliyhdisteiden kokonaispitoisuus väheni myös varastoinnin aikana molemmissa tutkituissa näytteissä (taulukko 1). Sandrin ym. tutkimus.72osoitti, että entsyymikäsitelty omenamehu voi säilyttää antioksidanttiaktiivisuutensa ja fenoliyhdisteiden pitoisuutensa. Letteran ym. tutkimuksen tulokset kuitenkin osoittavat, että73osoittavat, että appelsiinimehun käsittely sienilakkaasilla voi vähentää sen fenoliyhdisteiden pitoisuutta jopa 45 %.
Fenoliyhdisteillä on osoitettu olevan ominaisuuksia, kuten vapaiden radikaalien sieppaus, singlettihapen pelkistys ja sammutus, vetyatomin siirto ja elektronin luovutus vapaille radikaaleille, mikä tekee niistä tehokkaita antioksidantteja.74Siksi tässä tutkimuksessa käytettiin DPPH- ja FRAP-pohjaisia menetelmiä arvioimaan lakkaasin vaikutusta jääkaapissa 14 päivää säilytetyn omenamehun antioksidanttiaktiivisuuteen (taulukko 2). Molemmat menetelmät osoittivat antioksidanttiaktiivisuuden lisääntymistä varastoinnin aikana, mikä voi johtua vapaiden fenoliyhdisteiden lisääntymisestä tai Maillard-reaktiotuotteiden (MRP) muodostumisesta, ja Maillard-reaktiotuotteet ovat todennäköisesti antioksidanttiaktiivisuuden lisääntymisen syy.75Ei-entsymaattiset ruskistumisreaktiot (mukaan lukien askorbiinihapon hajoaminen, Maillard-reaktiot ja happokatalysoitu sokereiden hajoaminen) tuottavat ruskeita pigmenttejä (melanoidiineja). Askorbiinihapon ja sokerien hajoamistuotteet (kuten karbonyyliyhdisteet) voivat reagoida aminohappojen kanssa Maillard-reaktioiden kautta.76Vaikka hedelmien ja vihannesten ruskistumista varastoinnin aikana on tutkittu laajasti, ymmärryksemme näistä reaktioista on edelleen rajallista.77FRAP-menetelmään verrattuna lakkaasikäsitellyn omenamehun antioksidanttiaktiivisuus oli DPPH-menetelmällä mitattuna merkittävästi alhaisempi (taulukko 2), ja kaikkien näytteiden antioksidanttiaktiivisuus kasvoi merkittävästi säilytysajan pidentyessä. Tässä tutkimuksessa käytettiin kahta eri menetelmää antioksidanttiaktiivisuuden määrittämiseksi, koska niiden periaatteet eroavat toisistaan. DPPH-menetelmä mittaa kykyä neutraloida vapaita radikaaleja, kun taas FRAP-menetelmä mittaa kykyä pelkistää rautaioneja. Siksi on suositeltavaa käyttää useita menetelmiä antioksidanttiaktiivisuuden määrittämiseksi, jotta tutkittujen näytteiden antioksidanttiaktiivisuus ymmärretään paremmin.78
Yksi tämän tutkimuksen keskeisistä löydöksistä on, että *Pleurotus ostreatus* -lakkaasi NRC 620:lla on optimaalinen aktiivisuus 70 °C:ssa ja pH-arvossa 3,0. Verrattuna muihin mehun kirkastuksessa yleisesti käytettyihin sienilakkaaseihin, kuten *Trametes versicolor*- ja *Ganoderma lucidum* -lakkaaseihin, *P. ostreatus* NRC 620:lla on parempi terminen stabiilius ja happamampi pH. *Trametes versicolor*- ja *Ganoderma lucidum* -lakkaasit osoittavat tyypillisesti optimaalista aktiivisuutta 50–60 °C:n lämpötilassa ja pH-arvoissa 3,5–5,0. Tämä ero voi parantaa mehun kirkastustehokkuutta, erityisesti happamissa mehuissa, joissa stabiilius alhaisemmissa pH-arvoissa on kriittistä. *P. ostreatus* NRC 620:n ainutlaatuinen ominaisuus on se, että verrattuna muihin tutkittuihin sienilakkaaseihin, *Pleurotus ostreatus* NRC 620:lla on kyky toimia tehokkaasti haastavammissa olosuhteissa. Sen korkeampi optimaalinen aktiivisuuslämpötila viittaa potentiaalisiin etuihin teollisissa sovelluksissa, kuten nopeampiin reaktionopeuksiin ja vähentyneeseen mikrobikontaminaatioon. Sen matala pH, joka sopii hyvin monien mehujen happamaan luonteeseen, voi olla hyödyllinen mehujen kirkastusprosesseissa. Nämä tulokset oikeuttavat jatkotutkimukset laajamittaista käyttöä varten, mikä tekee *Pleurotus ostreatus* NRC 620:sta käyttökelpoisen vaihtoehdon perinteisille sienilakkaasilähteille. Aiempiin tutkimuksiin verrattuna havaitsimme, että optimaalinen lämpötila on 60 °C ja optimaalinen pH on 3,0. 80 minuutin reaktion jälkeen 60 °C:ssa *Ganoderma lucidum* -lakkaasi säilytti46% sen toiminnasta.79 Kurniawatin ja Nicellen mukaan80*Ganoderma lucidum* -entsyymit osoittavat erinomaista tai kohtalaista stabiiliutta 25 °C:ssa ja pH-arvoissa 5,0–8,0, sekä stabiiliutta pH-arvossa 6,0 ja lämpötiloissa 10–30 °C. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että optimaalinen pH ja lämpötila entsyymiaktiivisuudelle *Pleurotus ostreatus*:lla olivat 3,0 ja 70 °C. Kahden tunnin inkuboinnin jälkeen 40 °C:ssa ja 50 °C:ssa entsyymi säilytti 68,33 % ja 59,61 % aktiivisuudestaan. Lisäksi Pleurotus ostreatus NRC 620 -lakkaasi osoitti korkeaa aktiivisuutta laajalla lämpötila-alueella 50 °C:sta 80 °C:seen, saavuttaen lähes maksimiaktiivisuuden (69–98 %), ja maksimiaktiivisuus havaittiin 70 °C:ssa.
Yhteenvetona voidaan todeta, että staattisissa olosuhteissa saatu osterivinokkaasi NRC620 osoitti optimaalista aktiivisuutta ja stabiiliutta useissa pH- ja lämpötilaolosuhteissa, mikä osoittaa parempaa stabiiliutta verrattuna muihin entsyymilähteisiin. 10 mM MgSO₄:n ja CuSO₄:n lisääminen lisäsi entsyymiaktiivisuutta noin 21 % ja 35 %. Omenamehuksi prosessoituna entsyymi alensi pH:ta ja viskositeettia, kun taas fenolipitoisuus laski vain hieman varastoinnin aikana.
Tulokset vahvistavat lakkaasin potentiaalin elintarviketeollisuudessa, erityisesti juomien kirkastuksessa. Hajottamalla spesifisesti fenoliyhdisteitä lakkaasi paitsi vähentää sameutta ja parantaa kirkkautta, myös ylläpitää hedelmämehujen laatua miedoissa käyttöolosuhteissa. Toisin kuin perinteiset kirkastusaineet, kuten gelatiini, bentoniitti ja silikageeli, lakkaasi ei tuota jätettä eikä poista juomista miellyttäviä aromeja, mikä tekee siitä ympäristöystävällisemmän ja kestävämmän vaihtoehdon. Lisäksi verrattuna muihin entsyymeihin ja suodatusmenetelmiin, lakkaasi tarjoaa kohdennetun ja kustannustehokkaan ratkaisun vaarantamatta tuotteen laatua.
Kyomuhimbo, HD ja Brink, HG. Kuparia sisältävien lakkaasien sovellukset ja immobilisointistrategiat; katsaus. Heliyon 9, e13156 (2023).
Julkaisun aika: 15.12.2025